RESUMO
Leptospirosis is a public health concern with lethality around 15% of the total cases. The current vaccines against Leptospira infection based on bacterins have several limitations, which require urgent development of new ones. In this context, groundbreaking approaches such as peptide-vaccines could be used to come around with promising results. Our goal was to identify conserved and immunogenic epitopes from the lipoprotein LruC that could interact with Major Histocompatibility Complex (MHC) I and II. LruC is a conserved lipoprotein expressed during leptospirosis that is considered among vaccine candidates and can be used as source for development of peptide-based vaccines. We searched for peptides that would be recognized by antibodies from either serum of hamsters previously immunized with low-LPS bacterin vaccines or from serum of patients diagnosed with leptospirosis. Immuno properties of seven peptides from LruC protein were evaluated in silico and by Dot Blot assay, and validate by ELISA. Preliminary results pointed one promising peptide that was recognized by the sera. In conclusion, the immunoinformatic approach helps the search and screening of peptides, while the Dot Blot assay, a simple and effective tool, helps to test and validate them. Thus, these prospective techniques together were validated to identify and validate potential peptides for further investigation as peptide-based vaccines or diagnostic methods.
RESUMO
Leptospirosis is caused by bacteria of the genus Leptospira and is responsible for about 60 thousand deaths annually worldwide. The infection occurs through direct or indirect contact with contaminated animals' urine because the bacteria colonize the renal tubes e are excreted in the urine, which can cause renal insufficiency. The bacteria can also spread into the lungs and liver, causing fever, lungs hemorrhage, and hepatic insufficiency with lethality in about 15% of cases. Nowadays, there are about 13 pathogenic species of Leptospira with more than 200 serovars described in the literature. This diversity hinders vaccine and diagnostic methods development, which could cover such variability. Thus, the study aims to check peptides' recognition capacity from Leptospira proteins by hamsters’ serum previously immunized with an anti-Leptospirosis’ vaccine with reduced LPS. To do so, seven peptides were designed and analyzed in silico, synthesized, and evaluated by the Dot Blot technique. The selected peptides were applied into a 0,45 μm nitrocellulose membrane and incubated with the serum of immunized animals to verify possible recognitions. Next, the membranes were incubated with a secondary antibody conjugated with peroxidase. The membranes were revealed using ECL kit and the chemiluminescent signal was detected by the Cambridge Uvitec. Preliminary results showed specific recognition capability of three of the seven designed peptides from Leptospira proteins. The remaining peptides did not show a detectable signal or showed possible non-specific interactions. Therefore, we concluded that the Dot Blot technique could be a simple and effective technique used to analyze and identification of epitopes and proteins able to induce antibodies in immunizations or natural infections. Besides that, the identification of peptides able to recognize specifically anti-Leptospira antibodies is a promising strategy for diagnostic test development and identification of possible candidates for vaccines development.
A leptospirose é causada por bactérias do gênero Leptospira, sendo responsável por aproximadamente 60 mil mortes anualmente ao redor do mundo. O contágio se dá pelo contato direto ou indireto com a urina de animais contaminados, pois as bactérias colonizam os túbulos renais e são excretadas na urina podendo causar insuficiência renal. As bactérias também se disseminam nos pulmões e no fígado, podendo causar febre, hemorragias pulmonares e insuficiência hepática com letalidade em torno de 15% dos casos. Atualmente, cerca de 13 espécies patogênicas de Leptospira são descritas na literatura com mais de 200 sorovares. Essa diversidade dificulta o desenvolvimento de vacinas e métodos de diagnósticos que consigam cobrir tamanha variedade. Dessa forma, o estudo almeja averiguar a capacidade de reconhecimento de peptídeos oriundos de proteínas de Leptospira por soro de hamsters, previamente imunizados com vacinas anti-leptospirose com LPS reduzido. Para isso, sete peptídeos foram desenhados e analisados in silico, sintetizados e avaliados por técnica de Dot Blot. Os peptídeos selecionados foram aplicados em membranas de nitrocelulose 0,45 μm e incubados com o soro de animais imunizados, para verificar possíveis reconhecimentos. Em seguida, as membranas foram incubadas com o anticorpo secundário conjugado a peroxidase. As membranas foram reveladas com o kit ECL e o sinal detectado por quimioluminescência utilizando o aparelho Uvitec Cambridge. Os resultados preliminares demonstraram capacidade de reconhecimento especifico de três dos sete peptídeos desenhados a partir de proteínas de Leptospira. Os demais peptídeos não apresentaram sinal detectável ou evidenciaram possíveis interações inespecíficas. Com isso, concluimos que a técnica de Dot Blot pode ser uma ferramenta simples e eficaz utilizada para a análise e identificação de epítopos e peptídeos de proteínas capazes de induzir anticorpos em imunizações ou infecções naturais. Além disso, identificar peptídeos capazes de reconhecer especificamente anticorpos anti-Leptospira é uma estratégia promissora para o desenvolvimento de testes de diagnóstico e identificação de possíveis candidatos para o desenvolvimento de vacinas.
RESUMO
Leptospirosis is caused by bacteria of the genus Leptospira and is responsible for about 60 thousand deaths annually worldwide. The infection occurs through direct or indirect contact with contaminated animals' urine because the bacteria colonize the renal tubes e are excreted in the urine, which can cause renal insufficiency. The bacteria can also spread into the lungs and liver, causing fever, lungs hemorrhage, and hepatic insufficiency with lethality in about 15% of cases. Nowadays, there are about 13 pathogenic species of Leptospira with more than 200 serovars described in the literature. This diversity hinders vaccine and diagnostic methods development, which could cover such variability. Thus, the study aims to check peptides' recognition capacity from Leptospira proteins by hamsters’ serum previously immunized with an anti-Leptospirosis’ vaccine with reduced LPS. To do so, seven peptides were designed and analyzed in silico, synthesized, and evaluated by the Dot Blot technique. The selected peptides were applied into a 0,45 μm nitrocellulose membrane and incubated with the serum of immunized animals to verify possible recognitions. Next, the membranes were incubated with a secondary antibody conjugated with peroxidase. The membranes were revealed using ECL kit and the chemiluminescent signal was detected by the Cambridge Uvitec. Preliminary results showed specific recognition capability of three of the seven designed peptides from Leptospira proteins. The remaining peptides did not show a detectable signal or showed possible non-specific interactions. Therefore, we concluded that the Dot Blot technique could be a simple and effective technique used to analyze and identification of epitopes and proteins able to induce antibodies in immunizations or natural infections. Besides that, the identification of peptides able to recognize specifically anti-Leptospira antibodies is a promising strategy for diagnostic test development and identification of possible candidates for vaccines development.
A leptospirose é causada por bactérias do gênero Leptospira, sendo responsável por aproximadamente 60 mil mortes anualmente ao redor do mundo. O contágio se dá pelo contato direto ou indireto com a urina de animais contaminados, pois as bactérias colonizam os túbulos renais e são excretadas na urina podendo causar insuficiência renal. As bactérias também se disseminam nos pulmões e no fígado, podendo causar febre, hemorragias pulmonares e insuficiência hepática com letalidade em torno de 15% dos casos. Atualmente, cerca de 13 espécies patogênicas de Leptospira são descritas na literatura com mais de 200 sorovares. Essa diversidade dificulta o desenvolvimento de vacinas e métodos de diagnósticos que consigam cobrir tamanha variedade. Dessa forma, o estudo almeja averiguar a capacidade de reconhecimento de peptídeos oriundos de proteínas de Leptospira por soro de hamsters, previamente imunizados com vacinas anti-leptospirose com LPS reduzido. Para isso, sete peptídeos foram desenhados e analisados in silico, sintetizados e avaliados por técnica de Dot Blot. Os peptídeos selecionados foram aplicados em membranas de nitrocelulose 0,45 μm e incubados com o soro de animais imunizados, para verificar possíveis reconhecimentos. Em seguida, as membranas foram incubadas com o anticorpo secundário conjugado a peroxidase. As membranas foram reveladas com o kit ECL e o sinal detectado por quimioluminescência utilizando o aparelho Uvitec Cambridge. Os resultados preliminares demonstraram capacidade de reconhecimento especifico de três dos sete peptídeos desenhados a partir de proteínas de Leptospira. Os demais peptídeos não apresentaram sinal detectável ou evidenciaram possíveis interações inespecíficas. Com isso, concluímos que a técnica de Dot Blot pode ser uma ferramenta simples e eficaz utilizada para a análise e identificação de epítopos e peptídeos de proteínas capazes de induzir anticorpos em imunizações ou infecções naturais. Além disso, identificar peptídeos capazes de reconhecer especificamente anticorpos anti-Leptospira é uma estratégia promissora para o desenvolvimento de testes de diagnóstico e identificação de possíveis candidatos para o desenvolvimento de vacinas.
